La coltura liquida: fase 3 - la clonazione.

Esistono molti modi per inoculare un barattolo di soluzione nutriente come quello che abbiamo preparato: il più semplice è iniettandovi dentro un po' di LC già pronta, ma questo implica l'avere già a disposizione una siringa di micelio liquido, magari comprata da un laboratorio specializzato.
In questo post parleremo però della tecnica della clonazione, che ci permetterà di ricavare da soli la nostra coltura, partendo da un fungo già formato. Anche se il titolo pare quello di un film di fantascienza, è tutto vero: dovremo infatti mettere in atto una vera e propria clonazione, fortunatamente molto più semplice di quella della pecora Dolly :). Non si tratta comunque di un'operazione semplicissima, e dovremo usare tutte le cautele possibili per evitare che qualcosa vada storto.
Il micelio ha la capacità di ricrescere dal tessuto del fungo da lui stesso generato. Per fare un esempio (forse stupido), è come se tagliando uno spicchio di mela e sotterrandolo, questo mettesse le radici e desse vita ad un bell'alberello, senza aver bisogno di nessun seme. Tagliando un frammento di fungo e posizionandolo in un ambiente favorevole (presenza di nutrienti ed assenza di muffe e batteri competitori) il micelio ricrescerà, e già dopo qualche giorno vedremo il pezzetto di fungo coperto di una peluria bianca.
Nel nostro caso, l'obiettivo è prelevare un pezzetto di fungo e riuscire a metterlo nel barattolo. Il problema è che, per farlo, non potremo aprire il coperchio. Infatti, nella normale aria che respiriamo fluttuano continuamente milioni di spore di batteri e muffe, ed il rischio che qualcuna entri dentro al momento dell'apertura sarebbe molto alto. Molti tipi di muffa, in particolare, crescono molto velocemente, e non darebbero al nostro micelio nemmeno la possibilità di nascere. Dovremo quindi prelevare il frammento di fungo con una siringa, ed iniettarlo letteralmente dentro al barattolo, tramite la porta d'inoculo in silicone che avremo precedentemente preparato seguendo l'apposita guida. La procedura dev'essere svolta con la massima cautela, in un ambiente il più pulito possibile, prelevando il pezzo di fungo da un punto particolarmente pulito, ed utilizzando una siringa sterilizzata. Ma adesso basta con le chiacchiere e vediamo come fare:

Per prima cosa dovremo innestare l'ago 18G nella nostra siringa , ed in seguito sterilizzarla. In genere le siringhe sono fatte di polipropilene, un tipo di plastica che resiste alle alte temperature senza problemi. Da nuove le siringhe sono già sterili, ma cambiando l'ago potrebbero contamiarsi, quindi sterilizzandole si rischia meno. Per sterilizzarle procediamo così:

Innestiamo gli agli 18G (aghi più piccoli non funzionerebbero)

Le avvolgiamo nella carta stagnola...

 ... e le sterilizziamo in pentola a pressione. Non vanno immerse nell'acqua, ci penserà il vapore a compiere l'opera. Possiamo tranquillamente sterilizzarle insieme ai barattoli, poiché 15 minuti sono più che sufficienti.

Una volta sterilizzata la siringa, possiamo passare all'opera. Ecco ciò che ci servirà:

Il barattolo da inoculare, la siringa sterilizzata, il caramellatore (oppure possiamo usare la fiamma di un fornello), un po' di acqua ossigenata o alcool, ed un fungo (il più giovane possibile) da cui prelevare una "carota" di tessuto. Non tutti i tipi di fungo si prestano alla clonazione con siringa, ad esempio il Pleurotus ostreatus ha una carne molto fibrosa che rimane con difficoltà dentro l'ago, rendendo le cose ancora più difficili. In questo caso ho usato un pioppino (A. aegerita). Con questa tecnica è meglio clonare funghi coltivati, comprati al supermercato. Quelli selvatici sono il più delle volte molto sporchi, e dovremo ricorrere all'agar per effettuare l'operazione, pena una percentuale di fallimenti molto alta.
Il punto migliore per prelevare il frammento di tessuto è il gambo. Quindi, procediamo a pulire accuratamente l'area interessata con un pezzo di carta/batuffolo di cotone imbevuto di acqua ossigenata o alcool.

Scartiamo la siringa, togliamo l'elastico e la carta stagnola dal barattolo, ed aspiriamo qualche ml di soluzione. Attenzione a non bagnare il filtro, altrimenti è tutto da rifare.

Subito dopo mettiamo un po' di carta imbevuta di acqua ossigenata/alcool sopra alla porta di inoculo:

Poi sterilizziamo l'ago della siringa con la fiamma, finché non diventa completamente rosso. Occhio a non sciogliere la plastica della siringa.

Poi aspettiamo che l'ago si raffreddi (10 secondi circa) e "buchiamo" il fungo nell'area appena pulita. Evitiamo di entrare in contatto con le spore.

Se cloniamo un fungo più grosso come un Pleurotus, possiamo romperlo a metà e prelevare il tessuto dalla parte interna, che in genere è molto più pulita.
A questo punto, se abbiamo fatto le cose correttamente (e con un pizzico di fortuna) un pezzetto di fungo sarà rimasto dentro l'ago della siringa. Procediamo quindi ad iniettare tutto dentro al barattolo, togliendo il batuffolo sopra al silicone immediatamente prima di infilare l'ago.

Se tutto è andato per il verso giusto, potremo vedere il frammento che fluttua nel liquido.

Nel giro di 5-7 giorni, dovremmo vedere una sottile peluria ricoprire il pezzettino di fungo. Se invece abbiamo sbagliato qualcosa, nel giro di un paio di giorni vedremo il liquido diventare di un bianco-grigio sporco, e divenire maleodorante.
Ecco una foto per mostrarvi cosa dovete aspettarvi in caso di successo:

 

Come potete vedere, il micelio cresce direttamente dal frammento di tessuto. e volete velocizzare la crescita del micelio, sarà sufficiente agitare di tanto in tanto il barattolo, in modo da rompere il micelio in numerosi filamenti. Ognuno di essi riprenderà a crescere, velocizzando il processo.
L'importante è stare sempre attenti a non bagnare il filtro, infatti il miele contenuto nel liquido favorirebbe la contaminazione della soluzione.
Una volta che il liquido diventerà completamente trasparente, vorrà dire che la nostra LC è pronta da usare, perché il micelio ha consumato tutti i nutrienti.