Inoculare i semi con la coltura liquida

Bene, è arrivato il momento di dare i barattoli di semi in pasto al nostro micelio,così da ottenere il nostro spawn. Per prima cosa sterilizziamo una siringa, avvolgendola nelle carta stagnola e tenendola in pentola a pressione per 15-20 minuti, come già visto in questo post. Una volta pronta, la togliamo dalla pentola senza scartarla, e prepariamoci al lavoro, in un ambiente il più pulito possibile. È buona cosa spruzzare in aria un po' di alcool o disinfettante spray (l'Oust funziona bene) prima di iniziare.

Per prima cosa, puliamo accuratamente la porta di inoculo del barattolo di LC con un batuffolo di carta o cotone, imbevuto di acqua ossigenata. Fatto questo, prendiamo un altro batuffolo imbevuto e lo teniamo sopra alla porta di inoculo per 5-10 minuti. Questo per uccidere gli eventuali contaminanti rimasti.

Adesso dobbiamo lavorare nel modo più rapido ed asettico possibile: scartiamo la siringa e velocemente inseriamo l'ago nella porta di inoculo. Poi incliniamo il barattolo quanto basta perché l'ago arrivi al liquido. Bisogna stare sempre molto attenti a non bagnare il filtro, per i motivi che sappiamo. Il nostro obiettivo è riuscire ad aspirare quanto più micelio possibile dentro alla siringa: durante la crescita quest'ultimo tende a formare una massa compatta, che non passa facilmente dall'ago. Per questo dovremo "rompere" in filamenti la massa di micelio aspirando e soffiando più volte il liquido. Tutta l'operazione dev'essere ovviamente fatta senza mai togliere l'ago dal barattolo. 

Una volta che saremo riusciti ad aspirare una quantità decente di micelio, possiamo togliere l'ago dal barattolo. A questo punto, è buona cosa sterilizzare l'ago della siringa con la fiamma, prima di inoculare nel barattolo. Se si lavora rapidi non ce ne è bisogno, ma è sempre meglio andare sul sicuro. Una volta sterilizzato l'ago e raffreddato (10 secondi circa) togliamo la carta stagnola dal barattolo di semi, e vi iniettiamo la LC.

Con un po' d'attenzione è possibile inoculare diversi barattoli con una singola siringa di LC, basta che in ognuno finisca qualche filamento di micelio. Ovviamente, più ne mettiamo e più la colonizzazione sarà rapida. Ed ovviamente, è bene sterilizzare l'ago ad ogni passaggio.
Se tutto è andato per il verso giusto, nel giro di 4-7 giorni vedremo il micelio crescere nei semi.

Come vedete, il micelio inizia a svilupparsi nel punto in cui è stata iniettata la LC, proprio sotto la porta di inoculo. È possibile velocizzare la crescita del micelio sgranando i chicchie mischiandoli: dopo un paio di giorni la crescita ripartirà dai chicchi colonizzati, velocizzando il tutto. Per far ciò, sbattete il fondo del barattolo più volte contro una superficie "gommosa", coem un pneumatico oppure una suola di una scarpa da ginnastica. Una volta che tutti i semi saranno invasi dal micelio, il barattolo sarà pronto da usare.
Nel caso qualcosa sia andato storto, ve ne accorgerete: in caso di contaminazione batterica i semi assumeranno un aspetto vischioso e un odore sgradevole. In caso di contaminazione da muffa, invece, vedrete crescere una muffa polverosa di colore variabile, al posto di, oppure insieme al micelio. Ovviamente, in tutti questi casi è tutto da rifare. Ecco una foto per darvi un'idea: in questo caso il micelio si è sviluppato, ma insieme ad un ospite indesiderato...

Bene, se il vostro barattolo NON sembra come quello poco sopra, ma è invece tutto bianco di micelio, come nella foto qui sotto, allora sarà pronto da usare :)

Alla prossima!

Preparare lo spawn

Una volta che la nostra LC sarà pronta (e non è poco, vi serviranno probabilmente numerosi tentativi), verrà il momento di usarla. Tuttavia, non è una buona idea iniettarla direttamente sul substrato finale (paglia, segatura, tronchi di legno ecc.). Questo perché la crescita sarebbe eccessivamente lenta, esponendo il tutto a rischi di contaminazione, oppure potrebbe non partire neppure. Sarà quindi necessario un passaggio intermedio, in grado di dare al nostro micelio "una marcia in più", permettendogli di crescere in modo rapido ed aggressivo. Tale passaggio intermedio è, appunto, la preparazione dello "spawn" (in inglese, letteralmente, significa generare, moltiplicare). Lo spawn è un modo per moltiplicare il micelio, ottenendone abbastanza per poter poi inoculare il substrato finale. Il metodo maggiormente usato consiste nell'utilizzare semi di cereali, idratati e sterilizzati: essendo altamente proteici permettono al micelio di crescere in modo vigoroso e rapido.
Tuttavia i semi non sono adatti a permettere la fruttificazione, nell'ipotesi migliore da essi otterremmo solo qualche funghetto, ma noi vogliamo un raccolto consistente, giusto? :)
I semi devono essere necessariamente usati per inoculare il substrato definitivo: in questo modo fungeranno da supplemento nutritivo, e garantiranno una colonizzazione rapida, che la LC da sola non permetterebbe.
Il cereale migliore (e più usato) in assoluto per preparare lo spawn è la segale, ma vanno bene anche grano, sorgo, miglio e orzo. Potete trovarli tutti  negli ingrossi di sementi. Potete anche usare il mangime per cocorite, che spesso è composto prevalentemente da miglio.
In questa guida utilizzeremo la segale.

Per prima cosa dobbiamo dosare i semi, versandoli nei barattoli che vogliamo preparare per poco meno di metà. Dopo che avremo idratato la segale infatti, essa raddoppierà di volume, e riempiendo completamente i vasetti. I coperchi dovranno essere preparati seguendo questa guida.

 Versiamo il contenuto di tutti i barattoli in una pentola bella grossa...

... e versiamo acqua calda fino a sommergere completamente i semi. Questa fase ha una duplice funzione: idratare i semi, fino a fargli raggiungere il giusto grado di umidità interna, e far germinare le endospore, che potrebbero resistere alla sterilizzazione.

Chiudiamo la pentola con il coperchio ed aspettiamo 24 ore. Quando la riapriremo, noterete che si è formata una leggera schiuma in superficie, e l'acqua sembra frizzare. Questo perché le spore contenute nei semi sono germinate, ed i batteri hanno iniziato a fermentare. Scoliamo i semi (uno scolapasta va bene) e sciacquiamoli per un po' sotto acqua fredda (in modo da lavare via eventuali residui di sporco). Come potete notare, i chicchi appaiono vistosamente più grandi, a causa dell'acqua che hanno assorbito.

 A questo punto, se avessimo usato il miglio, che ha chicchi molto più piccoli, avremmo dovuto farlo bollire per almeno 15 minuti, in modo da fargli assorbire altra acqua ed evitare il loro eccessivo seccarsi durante la colonizzazione. Ma quest'operazione con la segale non è necessaria, perché i chicchi sono abbastanza grossi da assorbire l'acqua necessaria. Riempiamo quindi i barattoli, fino ad 1-2 cm dal coperchio.

Copriamo i barattoli con un foglio di carta stagnola, fermandolo con un elastico.

Adesso sterilizziamo tutto in pentola a pressione, per almeno un'ora (un'ora e mezza per sicurezza) a 15 PSI. I contenuti solidi infatti richiedono un tempo più lungo dei liquidi. In un'ora e mezza saremo sicuri che anche il centro di ogni singolo vasetto avrà raggiunto i 120° per un periodo sufficiente ad uccidere tutti i contaminanti.

Lasciamo raffreddare la pentola fino a temperatura ambiente (ci vogliono diverse ore). Una volta freddi, i barattoli sono pronti da inoculare!

I semi rimpicciliscono leggermente durante la sterilizzazione, ma comunque mantengono un grado di umidità sufficiente per poter essere aggrediti dal nostro micelio.

Bene, ed anche questa è fatta. Nel prossimo post vedremo come inoculare i nostri bei vasetti :)

La coltura liquida: fase 3 - la clonazione.

Esistono molti modi per inoculare un barattolo di soluzione nutriente come quello che abbiamo preparato: il più semplice è iniettandovi dentro un po' di LC già pronta, ma questo implica l'avere già a disposizione una siringa di micelio liquido, magari comprata da un laboratorio specializzato.
In questo post parleremo però della tecnica della clonazione, che ci permetterà di ricavare da soli la nostra coltura, partendo da un fungo già formato. Anche se il titolo pare quello di un film di fantascienza, è tutto vero: dovremo infatti mettere in atto una vera e propria clonazione, fortunatamente molto più semplice di quella della pecora Dolly :). Non si tratta comunque di un'operazione semplicissima, e dovremo usare tutte le cautele possibili per evitare che qualcosa vada storto.
Il micelio ha la capacità di ricrescere dal tessuto del fungo da lui stesso generato. Per fare un esempio (forse stupido), è come se tagliando uno spicchio di mela e sotterrandolo, questo mettesse le radici e desse vita ad un bell'alberello, senza aver bisogno di nessun seme. Tagliando un frammento di fungo e posizionandolo in un ambiente favorevole (presenza di nutrienti ed assenza di muffe e batteri competitori) il micelio ricrescerà, e già dopo qualche giorno vedremo il pezzetto di fungo coperto di una peluria bianca.
Nel nostro caso, l'obiettivo è prelevare un pezzetto di fungo e riuscire a metterlo nel barattolo. Il problema è che, per farlo, non potremo aprire il coperchio. Infatti, nella normale aria che respiriamo fluttuano continuamente milioni di spore di batteri e muffe, ed il rischio che qualcuna entri dentro al momento dell'apertura sarebbe molto alto. Molti tipi di muffa, in particolare, crescono molto velocemente, e non darebbero al nostro micelio nemmeno la possibilità di nascere. Dovremo quindi prelevare il frammento di fungo con una siringa, ed iniettarlo letteralmente dentro al barattolo, tramite la porta d'inoculo in silicone che avremo precedentemente preparato seguendo l'apposita guida. La procedura dev'essere svolta con la massima cautela, in un ambiente il più pulito possibile, prelevando il pezzo di fungo da un punto particolarmente pulito, ed utilizzando una siringa sterilizzata. Ma adesso basta con le chiacchiere e vediamo come fare:

Per prima cosa dovremo innestare l'ago 18G nella nostra siringa , ed in seguito sterilizzarla. In genere le siringhe sono fatte di polipropilene, un tipo di plastica che resiste alle alte temperature senza problemi. Da nuove le siringhe sono già sterili, ma cambiando l'ago potrebbero contamiarsi, quindi sterilizzandole si rischia meno. Per sterilizzarle procediamo così:

Innestiamo gli agli 18G (aghi più piccoli non funzionerebbero)

Le avvolgiamo nella carta stagnola...

 ... e le sterilizziamo in pentola a pressione. Non vanno immerse nell'acqua, ci penserà il vapore a compiere l'opera. Possiamo tranquillamente sterilizzarle insieme ai barattoli, poiché 15 minuti sono più che sufficienti.

Una volta sterilizzata la siringa, possiamo passare all'opera. Ecco ciò che ci servirà:

Il barattolo da inoculare, la siringa sterilizzata, il caramellatore (oppure possiamo usare la fiamma di un fornello), un po' di acqua ossigenata o alcool, ed un fungo (il più giovane possibile) da cui prelevare una "carota" di tessuto. Non tutti i tipi di fungo si prestano alla clonazione con siringa, ad esempio il Pleurotus ostreatus ha una carne molto fibrosa che rimane con difficoltà dentro l'ago, rendendo le cose ancora più difficili. In questo caso ho usato un pioppino (A. aegerita). Con questa tecnica è meglio clonare funghi coltivati, comprati al supermercato. Quelli selvatici sono il più delle volte molto sporchi, e dovremo ricorrere all'agar per effettuare l'operazione, pena una percentuale di fallimenti molto alta.
Il punto migliore per prelevare il frammento di tessuto è il gambo. Quindi, procediamo a pulire accuratamente l'area interessata con un pezzo di carta/batuffolo di cotone imbevuto di acqua ossigenata o alcool.

Scartiamo la siringa, togliamo l'elastico e la carta stagnola dal barattolo, ed aspiriamo qualche ml di soluzione. Attenzione a non bagnare il filtro, altrimenti è tutto da rifare.

Subito dopo mettiamo un po' di carta imbevuta di acqua ossigenata/alcool sopra alla porta di inoculo:

Poi sterilizziamo l'ago della siringa con la fiamma, finché non diventa completamente rosso. Occhio a non sciogliere la plastica della siringa.

Poi aspettiamo che l'ago si raffreddi (10 secondi circa) e "buchiamo" il fungo nell'area appena pulita. Evitiamo di entrare in contatto con le spore.

Se cloniamo un fungo più grosso come un Pleurotus, possiamo romperlo a metà e prelevare il tessuto dalla parte interna, che in genere è molto più pulita.
A questo punto, se abbiamo fatto le cose correttamente (e con un pizzico di fortuna) un pezzetto di fungo sarà rimasto dentro l'ago della siringa. Procediamo quindi ad iniettare tutto dentro al barattolo, togliendo il batuffolo sopra al silicone immediatamente prima di infilare l'ago.

Se tutto è andato per il verso giusto, potremo vedere il frammento che fluttua nel liquido.

Nel giro di 5-7 giorni, dovremmo vedere una sottile peluria ricoprire il pezzettino di fungo. Se invece abbiamo sbagliato qualcosa, nel giro di un paio di giorni vedremo il liquido diventare di un bianco-grigio sporco, e divenire maleodorante.
Ecco una foto per mostrarvi cosa dovete aspettarvi in caso di successo:

 

Come potete vedere, il micelio cresce direttamente dal frammento di tessuto. e volete velocizzare la crescita del micelio, sarà sufficiente agitare di tanto in tanto il barattolo, in modo da rompere il micelio in numerosi filamenti. Ognuno di essi riprenderà a crescere, velocizzando il processo.
L'importante è stare sempre attenti a non bagnare il filtro, infatti il miele contenuto nel liquido favorirebbe la contaminazione della soluzione.
Una volta che il liquido diventerà completamente trasparente, vorrà dire che la nostra LC è pronta da usare, perché il micelio ha consumato tutti i nutrienti.

La coltura liquida: fase 2

Una volta preparati i tappi seguendo la guida precedente, possiamo a passare al gradino successivo: la preparazione della soluzione in cui coltivare il micelio. Come già accennato, è possibile utilizzare diversi tipi di nutrienti: miele, sciroppo d'acero, estratto di malto, zucchero di canna grezzo (gli zuccheri raffinati non funzionano bene), ecc. All'estero si usa principalmente sciroppo di mais, ma qui da noi è introvabile o quasi; fortunatamente le alternative non mancano, ad esempio ultimamente mi sto trovando molto ben con lo sciroppo d'agave. La preferenza, in ogni caso, va data alla sostanza che, dopo essere stata mischiata all'acqua, lascerà la soluzione il più trasparente possibile. Infatti, un'eventuale contaminazione batterica si manifesterebbe con un improvviso intorbidimento della soluzione, che diventa lattiginosa e maleodorante. Mantenendo la soluzione chiara, è possibile accorgersene tempestivamente, e ricominciare di nuovo il prima possibile, senza perdere tempo.
In questa guida illustrerò la preparazione classica con miele d'acacia, che detto fra noi non è l'ingrediente migliore in assoluto, ma funziona abbastanza bene. Voi non esitate a sperimentare altri "ingredienti" ;)
La percentuale di nutrienti da aggiungere è piuttosto bassa, e va dal 2% al 4%. Non vale la regola "più nutrienti = crescita più veloce". Anzi, se aggiungete troppo miele la crescita potrebbe essere molto lenta, o non partire neppure.
Misuriamo l'acqua distillata e versiamola nel barattolo (se non ne avete potete usare acqua di bottiglia, naturale). Probabilmente si ingiallirà dopo la sterilizzazione, ma non influirà sulla crescita del micelio. In base alla quantità d'acqua utilizzata, aggiungiamo il miele. Con un bilancino di precisione è molto semplice dosare la quantità, altrimenti potete mettere un cucchiaino abbondante per 300 ml. Nel nostro caso, per 300 ml servirebbero, al 4%, 12 grammi di miele. Mettiamone 9-10 per sicurezza.

Mescoliamo finché il miele non si è completamente disciolto nell'acqua. Poi mettiamo un foglio di carta stagnola sopra al coperchio, e lo fissiamo con un elastico (quelli abbastanza spessi resistono senza problemi alla sterilizzazione)

 A questo punto la soluzione va sterilizzata. Infatti, gli zuccheri contenuti nel miele non piacciono solo al nostro (futuro) micelio, ma anche a moltitudini di batteri e muffe, le cui spore sono sicuramente già presenti all'interno del barattolo, e prenderebbero il sopravvento. In ogni caso, i 120° gradi della pentola a pressione saranno sufficienti a sbarazzarcene. Mettiamo allora il nostro barattolo nella pentola, e versiamo una-due dita d'acqua sul fondo. Possono sembrare poche, ma sono più che sufficienti, perché sarà il vapore generato all'interno della pentola a trasmettere il calore ai barattoli.

Nella foto si vede un solo barattolo nella pentola, ma più ne mettete e meglio è, almeno ammortizzate il costo del gas :) La mia pentola è dotata di distanziatori che separano i barattoli dall'acqua; se la vostra non ne ha uno, mettete uno straccio sul fondo, per evitare che i barattoli ballino il tip tap durante la sterilizzazione. Dovete anche evitare che si tocchino, perché potrebbero rompersi, se non possono stare sufficientemente distanti l'uno dall'altro teneteli separati con un altro straccio.
A questo punto chiudiamo la pentola e sterilizziamo per non più di 15 minuti (oltre potrebbero formarsi dei residui nel liquido, che impediscono la colonizzazione), iniziando a contarli dal "fischio" della pentola . Se avete una pentola con manometro, 10 psi sono più che sufficienti.

Passati i 15 minuti stacchiamo il gas. Lasciate compensare la pressione all'interno della pentola senza aprire la valvola della pentola. Una volta che la pressione è scesa a zero, possiamo togliere i barattoli dalla pentola (occhio a non bruciarvi!) e lasciarli raffreddare. Fatto questo, abbiamo finito anche questa fase. Ecco come deve presentarsi un barattolo pronto da inoculare:

Come potete vedere, il liquido si presenta leggermente opaco, a causa del miele discioltovi. Una volta inoculato, se tutto va bene, noterete che diventerà sempre più trasparente, man mano che il micelio consumerà i nutrienti. Se invece notate che appena tolto dalla pentola il liquido nel barattolo si presenta già completamente trasparente, con residui bianchi depositati sul fondo, significa che qualcosa è andato storto. Provate a cambiare marca di miele, o sterilizzare per meno tempo (10-12 minuti).

Bene, per il momento anche questa fase è conclusa, alla prossima ;)

La coltura liquida: fase 1

Come accennato poco fa, la coltura liquida consiste in micelio coltivato in una soluzione di acqua e nutrienti, che possono essere di vario genere (per iniziare useremo il miele). Come recipienti useremo dei normali barattoli, come quelli che abbiamo visto nel precedente post. È tuttavia necessario operare una modifica ai relativi tappi: va infatti applicato un filtro per permettere lo scambio di gas, e creata una porta di inoculo che ci permetterà di inoculare i barattoli e di aspirare il micelio al momento giusto. Il procedimento è molto semplice.

Prendiamo il nostro bel barattolo ancora vergine:

 

Svitiamo il tappo e (con un trapano, un dremel, un cacciavite usato a mo' di scalpello o quello che volete) facciamo due buchi, ai due lati del barattolo, uno più piccolo ed uno più grande (occhio a non bucare la filettatura!).

Applichiamo un po' di silicone sia sopra, che sotto il buco più piccolo, modellandolo in modo che rimanga un po' in rilievo su entrambi i lati:

 

Una volta che il silicone si è seccato (ci vogliono un paio d'ore circa) facciamo una pallina di polyfill e la incastriamo a forza nell'altro foro più grande:

 

Bene, il nostro tappo è pronto. Possiamo così passare alla fase successiva, che spiegherò nel prossimo post ;)

L'attrezzatura di base per iniziare

Generalmente la prima tecnica che si impara è la coltura liquida. Non perché sia la più semplice, anzi forse non lo è, ma perché è realizzabile con materiali di facile reperimento. Imparare a lavorare con l'agar è il gradino successivo, ma richiede attrezzatura un po' più costosa e magari un po' di esperienza in più, e per questo ne parleremo successivamente.
In questo post elencherò i materiali che dovrete procurarvi per poter mettere in atto i vostri primi esperimenti con la coltura liquida. Si tratta di materiali di non difficile reperimento, ma che non è certo scontato avere in casa :) Iniziamo:


1) Barattoli di vetro qualsiasi, come questi vanno bene. I Bormioli sono i migliori perché hanno il vetro più spesso e resistono a più cicli di sterilizzazione, ma sono anche più costosi.

2) Siringhe in polipropilene (tipo di plastica che resiste alle alte temperature), da 10 o 20 ml, e che troverete facilmente in farmacia

3)  Aghi 18G, li troverete in farmacia. Hanno l'attacco rosa, e sono più grossi di quelli che si trovano normalmente con le siringhe.

4) Lana filtrante per acquari (polyfill). È una lana sintetica che trovate nei negozi di animali, oppure anche al supermercato. Spesso la usano per imbottire i cuscini.

6) Miele d'acacia. Anche il millefiori va bene ma quello d'acacia è il più chiaro, e funziona meglio. Poi spiegherò i dettagli.

7) Acqua distillata; anche l'acqua del rubinetto funziona, ma spesso diventa gialla dopo la sterilizzazione.

8) Una pentola a pressione. Per questa tecnica una qualsiasi va bene, non c'è bisogno che sia grossa come la mia ;)

 

9) Infine silicone, carta stagnola ed un po' di elastici di media larghezza. Non credo serva la foto :)

10) Opzionali: non sono indispensabili ma sono comodi da usare: un bilancino di precisione tipo questo, si trovano sul web a pochi euro. Servirà a dosare il miele, in alternativa possiamo fare "a occhio"...

...ed un caramellatore come questo. Servirà a sterilizzare l'ago della siringa. In alternativa possiamo usare la fiamma dei fornelli della cucina.

Nei prossimi post spiegherò come usare tutta questa bella roba.