Utilizzare agar e petri

Uno dei diversi usi cui le capsule di petri si prestano bene è quello della clonazione di un fungo. Avendo la possibilità di controllare le contaminazioni infatti, è possibile ricavare una coltura di micelio con maggior facilità rispetto che con la LC. Gli organismi competitori (muffe e batteri) saranno ben visibili nella piastra, e sarà quindi possibile salvare il micelio, semplicemente prelevandone un frammento con un bisturi sterile. Ovviamente le condizioni di lavoro dovranno essere le solite: glove-box o, meglio, cappa a flusso laminare, rispettando tutte le precauzioni necessarie.
Per clonare un fungo con le piastre di petri, il fondamento è lo stesso che nella LC: si tratta di prelevare un frammento o più dalla parte interna del fungo, e depositarla sull'agar. Nel giro di qualche giorno il micelio inizierà a crescere dal frammento, e passerà ad aggredire l'agar. Il passo successivo sarà procedere a prelevare un piccolo frammento di micelio, e depositarlo in un'altra piastra, così da ottenere una coltura pulita al 100%. Potremo poi usare il petri per inoculare i barattoli di spawn, semplicemente prelevando un triangolino di agar colonizzato e depositandolo nel barattolo, aprendolo e richiudendolo velocemente (ovviamente sempre in glove-box o davanti alla cappa a flusso laminare).

Ho realizzato un video che mostra come lavorare. Per prima cosa ricordatevi di lavarvi accuratamente le mani, preferibilmente con sapone antibatterico, o meglio ancora usare i guanti di lattice, disinfettandoli poi con alcool. Poiché il tessuto va prelevato dalla parte interna del fungo, dovrete prima romperlo a metà, senza tagliarlo, così che la parte centrìale del fungo non venga a contatto con la lama del bisturi, che potrebbe trasportare eventuali contaminanti presenti sulla parte esterna del fungo. Se lavorate con funghi dalla consistenza particolarmente elastica o dura, che non è possibile spezzare con facilità (ad esempio un Pleurotus ostreatus adulto) potete incidere leggermente solo lo strato superficiale del fungo con il bisturi, per poi spezzarlo con le mani e prelevare il frammento dalla parte centrale, che non è stata toccata dalla lama. Nel video che segue, ho appunto fatto così. Se lavorate di fronte ad una cappa a flusso laminare fate attenzione a non frapporre la mano tra il filtro ed il fungo, perché potreste provocare contaminazioni. Per aumentare le probabilità di riuscita, è buona cosa depositare più frammenti di tessuto in ogni piastra; se compaiono batteri o muffe, trasferite immediatamente un piccolo triangolino di micelio su di un'altra piastra, ed aspettate che il micelio si riprenda e ricominci la crescita (con le specie più aggressive già al secondo giorno). Questo metodo è utilizzabile anche per moltiplicare le colture; da un singolo petri se ne possono ricavare decine e decine; di questo però parlerò in un post successivo.
Dopo l'inoculazione, le piastre devono essere sigillate. Il miglior metodo per farlo è utilizzare il Parafilm.

Si tratta di una pellicola appositamente studiata per questo tipo di utilizzo: elastica, impermeabile e che allo stesso tempo favorisce o scambio gassoso. Potete trovarla negli ingrossi di microbiologia; è piuttosto costosa ma un rotolo vi basterà per migliaia di petri. Se non avete la possibilità di trovarla, potete usare la solita pellicola che abbiamo già utilizzato per sigillare i petri in fase di preparazione.

Di seguito il video:

 

Una volta che il petri è inoculato e sigillato, non resta che aspettare. Temperature intorno ai 20°-22° favoriscono la crescita, ma non vi consiglio di mettere i petri in un incubatore, perché gli sbalzi di temperatura favoriscono la formazione di condensa; si rischia di ritrovarsi con lo strato di agar rinsecchito ed il petri pieno d'acqua.
Nel giro di qualche giorno qualcosa inizierà sicuramente a crescere. Se avrete lavorato bene, con buona probabilità il micelio risulterà visibile nel giro di qualche giorno. Se notate la comparsa di muffe o batteri contemporaneamente a quella del micelio, trasferite al più presto un triangolino di agar colonizzato su una piastra pulita, ed aspettate che ricresca. Se invece notate la crescita di solo micelio, potete anche trasferire dopo qualche giorno ancora.

Dopo qualche giorno dal trasferimento su di una piastra pulita (in questo caso 7 giorni) la crescita riprende ed aggredisce rapidamente l'agar della piastra. Una volta che la crescita è completa, la piastra è pronta da utilizzare.

Esistono innumerevoli tipi di organismi che possono proliferare sull'agar: se volete approfondire l'argomento, potete andare a ripassare un po' di biologia :) Qui però ci occupiamo di coltivazione di funghi commestibili, e quindi possiamo anche parlare in modo molto più generico. I 3 contaminanti più frequenti sono muffe, lieviti e batteri. I primi due appartengono al regno dei funghi, mentre i batteri appartengono ad uno autonomo. Le muffe si presentano come chiazze pelose dal colore e variabile (nero, verde, giallo, rosa, ecc.), anche se il loro colore iniziale è spesso bianco, cosa che può far cadere in errore, facendo credere che si tratti di micelio. La parte colorata della muffa è costituita da spore, che si possono facilmente spargere su tutta la piastra. La crescita delle muffe è spesso molto più rapida di quella del micelio, per cui se notate cambiamenti di colore sospetti preoccupatevi di trasferire il prima possibile il micelio vero in una piastra pulita.
I batteri invece si presentano come chiazze informi dall'aspetto lucido, simili a muco e dalla crescita rapidissima, spesso in grado di invadere un'intera piastra nel giro di uno o due giorni. 
In questa immagine sono visibili (in senso orario) una chiazza di micelio, una di batteri, ed una di muffa.

 

In questa invece si nota una chiazza di batteri che ha circondato un pezzetto di fungo pioppino (Agrocybe cylindracea). Ciò nonostante, il micelio è riuscito a superare la chiazza e bloccarne lo sviluppo, successivamente si sono addirittura formati minuscoli primordi sul frammento di tessuto! In questo caso per operare un trasferimento il micelio andrebbe prelevato da una zona incontaminata, come ad esempio quella indicata dalla freccia rossa.

I lieviti hanno invece una crescita più lenta, e crescono in chiazze dall'aspetto opaco. 

(L'immagine non è mia, l'ho presa da qui, poiché non ne avevo una disponibile, appena ho l'occasione la sostituirò.)

Spesso il micelio delle specie più aggressive aggira completamente le chiazze di lievito, bloccandone lo sviluppo, oppure le ingloba direttamente. In questa foto si notano alcune chiazze di lieviti al centro della piasstra, che sono sono state completamente inglobate dal micelio, che ne ha conseguentemente bloccato lo sviluppo.

 

Durante la colonizzazione, le piastre di petri prive di contaminanti possono essere conservate a temperatura ambiente, capovolte per evitare la formazione di condensa. Una volta pronte, si conservano in frigorifero dove possono durare un anno, o più, prima di seccarsi. In frigorifero però non devono essere messe capovolte, altrimenti ve le ritroverete piene d'acqua nel giro di qualche giorno. Per ovviare al problema, conservatele all'interno di scatole di plastica per alimenti, insieme a qualche sacchetto di essiccante, e poi riponete in frigorifero.

Alla prossima ;)