Preparare l'agar agar e versarlo nelle piastre petri

Siamo arrivati al fatidico momento della preparazione dell'agar agar con cui riempire le nostre capsule petri. Dico fatidico perché si tratta di una tecnica di fondamentale importanza da cui, una volta imparata, difficilmente ci si separa. Clonare un fungo con le piastre di petri è infatti più semplice rispetto alla coltura liquida, i risultati sono migliori e sono inoltre indispensabili per isolare una coltura pura partendo dalle spore (argomento che tratteremo tra un po').
In questo post vedremo come preparare la gelatina con cui riempire le piastre petri. Oltre all'agar, dovremo aggiungere al nostro "brodo" anche sostanze nutritive che possano essere metabolizzate dal micelio. In caso contrario la gelatina sarebbe troppo "povera", e non otterremmo alcuna crescita, o quasi. Esistono molte formule differenti: le più semplici ed utilizzate sono PDA (Potato-Dextrose-Agar), che prevede l'utilizzo di brodo di patate bollite e destrosio (potete usare del normale zucchero), e MEA (Malt Extract-Agar), che invece prevede l'aggiunta di estratto di malto. La prima è un po' più laboriosa, perché richiede una fase di prebollitura delle patate per circa 30 minuti, mentre la seconda è più semplice, perché richiede semplicemente di mescolare l'estratto di malto (che si trova sia in polvere che in sciroppo) all'agar. Ci sono decine e decine di altre formule: ad esempio c'è chi usa l'acqua di cottura degli spinaci, chi usa la farina d'avena, e chi addirittura il cibo per cani (non ci ho provato, e sinceramente non ci tengo!). Io preferisco mantenermi sul semplice, ed utilizzo una leggera variante delle ricette PDA e MEA, che prevede l'aggiunta di 1 grammo di lievito di birra al composto. In questo caso la ricetta si chiamerà PDYA (Potato-Dextrose-Yeast-Agar) o MEYA (Malt Extract- Yeast-Agar). L'aggiunta del lievito, che viene comunque inattivato con la sterilizzazione, permette una crescita migliore e più rapida con la maggior parte delle specie. La regola generale, in ogni caso, è sempre quella della coltura liquida: non devono essere aggiunti troppi nutrienti, poiché altrimenti il micelio diventa "pigro" e cresce lentamente. Noi invece lo vogliamo affamato, che cresca veloce in cerca di nuovo nutrimento.
Bene, direi di iniziare: la ricette che vedremo oggi è la PDYA. Potete comunque trasformarla in PDA semplicemente omettendo di aggiungere il lievito, la differenza non è molta. Riguardo alla quantità, le dosi sono quelle per 20 petri, che generalmente sono quelli che troviamo in una busta.

Sbucciate 150 grammi di patate e tagliatele a cubetti, mettetele in una pentola con 600 ml d'acqua (la dose per 20 petri in realtà è di 500 ml, ma un po' d'acqua evapora sempre durante la cottura)...

...e sobbollite per 30 minuti.

Poi, filtrate il liquido ed assicuratevi che la quantità sia giusta. È sempre meglio aggiungere 50 ml ai 500 richiesti, perché può capitare, soprattutto le prime volte, di versare troppo liquido in qualche petri, e si rischia di rimanere senza prima di averli riempiti tutti e 20 (ogni petri richiede circa 20-25 ml).

Versate il tutto in un barattolo di vetro, ed aggiungete 5 grammi di zucchero. Se il liquido si è raffreddato scaldiamolo per un po' in forno a microonde (altrimenti l'agar non si scioglierà bene).

Dopo di che pesiamo 8 grammi di agar (potete arrivare fino a 10 grammi, e scendere fino a 7,5, ottenendo una densità differente. 8 grammi è un buon compromesso, con quel che costa!)

Ed un grammo di lievito di birra

Fate attenzione che sia vero lievito, e non lievito istantaneo, che è un composto chimico e pertanto non va bene.

Aggiungiamo lievito ed agar al liquido, mescolando rapidamente. Vi ricordo che dev'essere caldo (non bollente) perché il tutto sciolga bene.

Versiamo il tutto in una bottiglia di vetro spesso.

Ovviamente dovete assicurarvi che entri nella vostra pentola a pressione.Nel caso in cui non ne trovaste una, potete utilizzare anche un barattolo abbastanza alto, modificando così il tappo. Ho detto sufficientemente alto perché l'agar bolle in modo molto violento, e se riempito troppo potrebbe traboccare.

Mettiamo una pallina di polyfill in cima alla bottiglia (o al barattolo)...

...e copriamo con un po' di carta stagnola.

A questo punto è tutto pronto per la sterilizzazione. Mettiamo la bottiglia nella pentola e sterilizziamo per 30-45 minuti.

Anche 10 psi vanno bene, trattandosi di un liquido. A tale pressione la pentola (almeno nel mio caso) sfiata meno, e si riducono i rischi che l'agar trabocchi dal recipiente.

Una volta trascorso il tempo necessario,spegnete il gas, e lasciate che la pressione scenda lentamente, senza assolutamente toccare la valvola. In caso contrario, il bilanciamento troppo rapido di pressione provocherà la fuoriuscita dell'agar dalla bottiglia. Una volta che la pressione sarà a zero, aprite la pentola e prelevate la bottiglia, ovviamente con una presina per non bruciarvi.

A questo punto, per poterla usare dovrete aspettare che si raffreddi fino a poter essere toccata a mani nude. Se avete una cappa a flusso laminare potete accenderla e lasciarvi davanti la bottiglia, che diventerà maneggiabile nel giro di 25-30 minuti. Se invece avete una glove-box vi consiglio di lasciare la bottiglia a raffreddarsi a temperatura ambiente, mettendola dentro alla glove-box solo quando è quasi pronta. Mettendola dentro ancora bollente, la condensa vi renderebbe la vita molto difficile. Nel caso in cui pensaste di usare la bottiglia ancora bollente, tenendola in mano con un panno, scordatevelo, perché altrimenti si formerebbe moltissima condensa nelle piastre, che diventerebbero inutilizzabili.
Le piastre petri le potete trovare da molti rivenditori online, o anche in alcune farmacie. Ce ne sono di diversi tipi e dimensioni, io uso quelle da 90 mm ventilate. Non sono riutilizzabili (in pentola a pressione si sciolgono) e dovete maneggiarle con molta cautela, evitando accuratamente di toccarne la parte interna.

Mi raccomando, non prendete esmpio da me, e fate in modo che la vostra area di lavoro sia un po' più ordinata della mia!
Prima di accendere la cappa, è bene spruzzarci un po' di oust da una distanza di 30-40 cm, e pulire bene il piano di lavoro con alcool. Stessa cosa per la glove-box, che è buona cosa pulire accuratamente prima di ogni utilizzo.

A questo punto, dovrete riempire le piastre. Per farvi vedere come, ho preparato un video, peraltro piuttosto brutto, ma spero che renda l'idea. Se cercate su youtube comunque si trova anche di meglio.
Sarebbe buona cosa indossare i guanti anche quando si lavora davanti alla cappa a flusso laminare, però se si ha cura di lavarsi accuratamente le mani non si incontrano problemi.

Una volta che la gelatina nelle piastre si sarà solidificata dovrete sigillarle una per una, sia per mantenerle unite insieme, sia per evitare contaminazioni. Un metodo molto funzionale è quello di tagliare a pezzetti un normale rotolo di pellicola da cucina, sigillando le piastre in questo modo:

Una volta pronte, le piastre possono essere conservate a temperatura ambiente per 1-2 mesi. Per periodi più lunghi è invece buona cosa conservarle in frigo. Generalmente comunque è sempre bene usarle il prima possibile, per evitare le (solite) contaminazioni.
Nel prossimo post vedremo come usare il frutto di questa nostra (ulteriore) fatica!

Alla prossima ;)