Probabilmente molti di voi avranno già sentito parlare (o già utilizzato) chiodi di micelio. Si tratta di semplici tasselli da falegname, ricoperti di micelio, che possono essere utilizzati per inoculare tronchi di legno, che poi vengono messi a fruttificare all'aperto oppure in serra. Utilizzando questo sistema i tempi sono molto più lunghi (da 6 mesi ad 1 anno), ma è molto più fedele al normale ciclo naturale, ed inoltre si tratta di un ottimo sistema per riciclare grossi tronchi che spesso rimarrebbero inutilizzati. Una volta che il micelio si sarà stabilito nel tronco, la produzione potrà andare avanti anche per anni, con crescite regolari in primavera ed autunno. In questa prima guida vedremo come preparare i chiodi, successivament spiegherò come inoculare i tronchi (operazione peraltro piuttosto semplice).
La prima cosa da fare è procurarsi dei tasselli da falegname. Mi riferisco a questi, per intenderci:
Li potete trovare in qualsiasi ferramenta, ad un costo accettabile. Successivamente, dovremo idratarli, per fargli assorbire una quantità d'acqua che sia sufficiente per farli aggredire dal micelio. Mettiamo la quantità desiderata di tasselli in una pentola d'acqua, e bolliamo a coperchio chiuso per circa mezz'ora (in alternativa potete lasciarli a bagno per 24 ore, il risultato dovrebbe essere lo stesso.
Dopo mezz'ora, i tasselli appariranno più "gonfi", scuri, e non galleggeranno più.
Notate la differenza tra un tassello secco ed uno idratato:
Bene, a questo punt è sufficiente mischiare i tasselli ad una manciata di cereali (già idratati, tenendoli a bagno per 24 ore come spiegato qui). In questo modo, una volta inoculati il micelio aggredirà prima i semi, per poi passare ai tasselli. Il barattolo così preparato va sterilizzato per un'ora e mezza, esattamente come per i normali cereali. Una volta sterilizzato e raffreddato, il barattolo è pronto da inoculare. Potete farlo con coltura liquida, come descritto qui, oppure depositandovi dentro un triangolino di agar colonizzato (a patto che lavoriate davanti a cappa a flusso laminare o in glove-box).
Una volta inoculato, non resta che aspettare che il micelio faccia il suo dovere. Questo è il risultato, dopo 15 giorni.
Una volta pronti, potete sgranare il barattolo dandogli un po' di colpi
contro una superficie gommosa (es. copertone dell'auto o suola di scarpa
da ginnastica) e separare i tasselli dai semi (che comunque potete
usare per inoculare segatura o paglia). Per togliere i tasselli io uso un paio di lunghe pinze da cucina, ma potete farlo anche a mano. Tenete conto che per inoculare un tronco di medie dimensioni (30 cm di diametro) dovrete usare non meno di 30 tasselli.
Alla prossima ;)
lunedì 18 marzo 2013
domenica 3 febbraio 2013
Utilizzare agar e petri
Uno dei diversi usi cui le capsule di petri si prestano bene è quello della clonazione di un fungo. Avendo la possibilità di controllare le contaminazioni infatti, è possibile ricavare una coltura di micelio con maggior facilità rispetto che con la LC. Gli organismi competitori (muffe e batteri) saranno ben visibili nella piastra, e sarà quindi possibile salvare il micelio, semplicemente prelevandone un frammento con un bisturi sterile. Ovviamente le condizioni di lavoro dovranno essere le solite: glove-box o, meglio, cappa a flusso laminare, rispettando tutte le precauzioni necessarie.
Per clonare un fungo con le piastre di petri, il fondamento è lo stesso che nella LC: si tratta di prelevare un frammento o più dalla parte interna del fungo, e depositarla sull'agar. Nel giro di qualche giorno il micelio inizierà a crescere dal frammento, e passerà ad aggredire l'agar. Il passo successivo sarà procedere a prelevare un piccolo frammento di micelio, e depositarlo in un'altra piastra, così da ottenere una coltura pulita al 100%. Potremo poi usare il petri per inoculare i barattoli di spawn, semplicemente prelevando un triangolino di agar colonizzato e depositandolo nel barattolo, aprendolo e richiudendolo velocemente (ovviamente sempre in glove-box o davanti alla cappa a flusso laminare).
Ho realizzato un video che mostra come lavorare. Per prima cosa ricordatevi di lavarvi accuratamente le mani, preferibilmente con sapone antibatterico, o meglio ancora usare i guanti di lattice, disinfettandoli poi con alcool. Poiché il tessuto va prelevato dalla parte interna del fungo, dovrete prima romperlo a metà, senza tagliarlo, così che la parte centrìale del fungo non venga a contatto con la lama del bisturi, che potrebbe trasportare eventuali contaminanti presenti sulla parte esterna del fungo. Se lavorate con funghi dalla consistenza particolarmente elastica o dura, che non è possibile spezzare con facilità (ad esempio un Pleurotus ostreatus adulto) potete incidere leggermente solo lo strato superficiale del fungo con il bisturi, per poi spezzarlo con le mani e prelevare il frammento dalla parte centrale, che non è stata toccata dalla lama. Nel video che segue, ho appunto fatto così. Se lavorate di fronte ad una cappa a flusso laminare fate attenzione a non frapporre la mano tra il filtro ed il fungo, perché potreste provocare contaminazioni. Per aumentare le probabilità di riuscita, è buona cosa depositare più frammenti di tessuto in ogni piastra; se compaiono batteri o muffe, trasferite immediatamente un piccolo triangolino di micelio su di un'altra piastra, ed aspettate che il micelio si riprenda e ricominci la crescita (con le specie più aggressive già al secondo giorno). Questo metodo è utilizzabile anche per moltiplicare le colture; da un singolo petri se ne possono ricavare decine e decine; di questo però parlerò in un post successivo.
Dopo l'inoculazione, le piastre devono essere sigillate. Il miglior metodo per farlo è utilizzare il Parafilm.
Si tratta di una pellicola appositamente studiata per questo tipo di utilizzo: elastica, impermeabile e che allo stesso tempo favorisce o scambio gassoso. Potete trovarla negli ingrossi di microbiologia; è piuttosto costosa ma un rotolo vi basterà per migliaia di petri. Se non avete la possibilità di trovarla, potete usare la solita pellicola che abbiamo già utilizzato per sigillare i petri in fase di preparazione.
Di seguito il video:
Una volta che il petri è inoculato e sigillato, non resta che aspettare. Temperature intorno ai 20°-22° favoriscono la crescita, ma non vi consiglio di mettere i petri in un incubatore, perché gli sbalzi di temperatura favoriscono la formazione di condensa; si rischia di ritrovarsi con lo strato di agar rinsecchito ed il petri pieno d'acqua.
Nel giro di qualche giorno qualcosa inizierà sicuramente a crescere. Se avrete lavorato bene, con buona probabilità il micelio risulterà visibile nel giro di qualche giorno. Se notate la comparsa di muffe o batteri contemporaneamente a quella del micelio, trasferite al più presto un triangolino di agar colonizzato su una piastra pulita, ed aspettate che ricresca. Se invece notate la crescita di solo micelio, potete anche trasferire dopo qualche giorno ancora.
Dopo qualche giorno dal trasferimento su di una piastra pulita (in questo caso 7 giorni) la crescita riprende ed aggredisce rapidamente l'agar della piastra. Una volta che la crescita è completa, la piastra è pronta da utilizzare.
Esistono innumerevoli tipi di organismi che possono proliferare sull'agar: se volete approfondire l'argomento, potete andare a ripassare un po' di biologia :) Qui però ci occupiamo di coltivazione di funghi commestibili, e quindi possiamo anche parlare in modo molto più generico. I 3 contaminanti più frequenti sono muffe, lieviti e batteri. I primi due appartengono al regno dei funghi, mentre i batteri appartengono ad uno autonomo. Le muffe si presentano come chiazze pelose dal colore e variabile (nero, verde, giallo, rosa, ecc.), anche se il loro colore iniziale è spesso bianco, cosa che può far cadere in errore, facendo credere che si tratti di micelio. La parte colorata della muffa è costituita da spore, che si possono facilmente spargere su tutta la piastra. La crescita delle muffe è spesso molto più rapida di quella del micelio, per cui se notate cambiamenti di colore sospetti preoccupatevi di trasferire il prima possibile il micelio vero in una piastra pulita.
I batteri invece si presentano come chiazze informi dall'aspetto lucido, simili a muco e dalla crescita rapidissima, spesso in grado di invadere un'intera piastra nel giro di uno o due giorni.
In questa immagine sono visibili (in senso orario) una chiazza di micelio, una di batteri, ed una di muffa.
Alla prossima ;)
Per clonare un fungo con le piastre di petri, il fondamento è lo stesso che nella LC: si tratta di prelevare un frammento o più dalla parte interna del fungo, e depositarla sull'agar. Nel giro di qualche giorno il micelio inizierà a crescere dal frammento, e passerà ad aggredire l'agar. Il passo successivo sarà procedere a prelevare un piccolo frammento di micelio, e depositarlo in un'altra piastra, così da ottenere una coltura pulita al 100%. Potremo poi usare il petri per inoculare i barattoli di spawn, semplicemente prelevando un triangolino di agar colonizzato e depositandolo nel barattolo, aprendolo e richiudendolo velocemente (ovviamente sempre in glove-box o davanti alla cappa a flusso laminare).
Ho realizzato un video che mostra come lavorare. Per prima cosa ricordatevi di lavarvi accuratamente le mani, preferibilmente con sapone antibatterico, o meglio ancora usare i guanti di lattice, disinfettandoli poi con alcool. Poiché il tessuto va prelevato dalla parte interna del fungo, dovrete prima romperlo a metà, senza tagliarlo, così che la parte centrìale del fungo non venga a contatto con la lama del bisturi, che potrebbe trasportare eventuali contaminanti presenti sulla parte esterna del fungo. Se lavorate con funghi dalla consistenza particolarmente elastica o dura, che non è possibile spezzare con facilità (ad esempio un Pleurotus ostreatus adulto) potete incidere leggermente solo lo strato superficiale del fungo con il bisturi, per poi spezzarlo con le mani e prelevare il frammento dalla parte centrale, che non è stata toccata dalla lama. Nel video che segue, ho appunto fatto così. Se lavorate di fronte ad una cappa a flusso laminare fate attenzione a non frapporre la mano tra il filtro ed il fungo, perché potreste provocare contaminazioni. Per aumentare le probabilità di riuscita, è buona cosa depositare più frammenti di tessuto in ogni piastra; se compaiono batteri o muffe, trasferite immediatamente un piccolo triangolino di micelio su di un'altra piastra, ed aspettate che il micelio si riprenda e ricominci la crescita (con le specie più aggressive già al secondo giorno). Questo metodo è utilizzabile anche per moltiplicare le colture; da un singolo petri se ne possono ricavare decine e decine; di questo però parlerò in un post successivo.
Dopo l'inoculazione, le piastre devono essere sigillate. Il miglior metodo per farlo è utilizzare il Parafilm.
Si tratta di una pellicola appositamente studiata per questo tipo di utilizzo: elastica, impermeabile e che allo stesso tempo favorisce o scambio gassoso. Potete trovarla negli ingrossi di microbiologia; è piuttosto costosa ma un rotolo vi basterà per migliaia di petri. Se non avete la possibilità di trovarla, potete usare la solita pellicola che abbiamo già utilizzato per sigillare i petri in fase di preparazione.
Di seguito il video:
Una volta che il petri è inoculato e sigillato, non resta che aspettare. Temperature intorno ai 20°-22° favoriscono la crescita, ma non vi consiglio di mettere i petri in un incubatore, perché gli sbalzi di temperatura favoriscono la formazione di condensa; si rischia di ritrovarsi con lo strato di agar rinsecchito ed il petri pieno d'acqua.
Nel giro di qualche giorno qualcosa inizierà sicuramente a crescere. Se avrete lavorato bene, con buona probabilità il micelio risulterà visibile nel giro di qualche giorno. Se notate la comparsa di muffe o batteri contemporaneamente a quella del micelio, trasferite al più presto un triangolino di agar colonizzato su una piastra pulita, ed aspettate che ricresca. Se invece notate la crescita di solo micelio, potete anche trasferire dopo qualche giorno ancora.
Dopo qualche giorno dal trasferimento su di una piastra pulita (in questo caso 7 giorni) la crescita riprende ed aggredisce rapidamente l'agar della piastra. Una volta che la crescita è completa, la piastra è pronta da utilizzare.
Esistono innumerevoli tipi di organismi che possono proliferare sull'agar: se volete approfondire l'argomento, potete andare a ripassare un po' di biologia :) Qui però ci occupiamo di coltivazione di funghi commestibili, e quindi possiamo anche parlare in modo molto più generico. I 3 contaminanti più frequenti sono muffe, lieviti e batteri. I primi due appartengono al regno dei funghi, mentre i batteri appartengono ad uno autonomo. Le muffe si presentano come chiazze pelose dal colore e variabile (nero, verde, giallo, rosa, ecc.), anche se il loro colore iniziale è spesso bianco, cosa che può far cadere in errore, facendo credere che si tratti di micelio. La parte colorata della muffa è costituita da spore, che si possono facilmente spargere su tutta la piastra. La crescita delle muffe è spesso molto più rapida di quella del micelio, per cui se notate cambiamenti di colore sospetti preoccupatevi di trasferire il prima possibile il micelio vero in una piastra pulita.
I batteri invece si presentano come chiazze informi dall'aspetto lucido, simili a muco e dalla crescita rapidissima, spesso in grado di invadere un'intera piastra nel giro di uno o due giorni.
In questa immagine sono visibili (in senso orario) una chiazza di micelio, una di batteri, ed una di muffa.
In questa invece si nota una chiazza di batteri che ha circondato un pezzetto di fungo pioppino (Agrocybe cylindracea). Ciò nonostante, il micelio è riuscito a superare la chiazza e bloccarne lo sviluppo, successivamente si sono addirittura formati minuscoli primordi sul frammento di tessuto! In questo caso per operare un trasferimento il micelio andrebbe prelevato da una zona incontaminata, come ad esempio quella indicata dalla freccia rossa.
I lieviti hanno invece una crescita più lenta, e crescono in chiazze dall'aspetto opaco.
(L'immagine non è mia, l'ho presa da qui, poiché non ne avevo una disponibile, appena ho l'occasione la sostituirò.)
Spesso il micelio delle specie più aggressive aggira completamente le chiazze di lievito, bloccandone lo sviluppo, oppure le ingloba direttamente. In questa foto si notano alcune chiazze di lieviti al centro della piasstra, che sono sono state completamente inglobate dal micelio, che ne ha conseguentemente bloccato lo sviluppo.
Durante la colonizzazione, le piastre di petri prive di contaminanti possono essere conservate a temperatura ambiente, capovolte per evitare la formazione di condensa. Una volta pronte, si conservano in frigorifero dove possono durare un anno, o più, prima di seccarsi. In frigorifero però non devono essere messe capovolte, altrimenti ve le ritroverete piene d'acqua nel giro di qualche giorno. Per ovviare al problema, conservatele all'interno di scatole di plastica per alimenti, insieme a qualche sacchetto di essiccante, e poi riponete in frigorifero.
martedì 1 gennaio 2013
Preparare l'agar agar e versarlo nelle piastre petri
Siamo arrivati al fatidico momento della preparazione dell'agar agar con cui riempire le nostre capsule petri. Dico fatidico perché si tratta di una tecnica di fondamentale importanza da cui, una volta imparata, difficilmente ci si separa. Clonare un fungo con le piastre di petri è infatti più semplice rispetto alla coltura liquida, i risultati sono migliori e sono inoltre indispensabili per isolare una coltura pura partendo dalle spore (argomento che tratteremo tra un po').
In questo post vedremo come preparare la gelatina con cui riempire le piastre petri. Oltre all'agar, dovremo aggiungere al nostro "brodo" anche sostanze nutritive che possano essere metabolizzate dal micelio. In caso contrario la gelatina sarebbe troppo "povera", e non otterremmo alcuna crescita, o quasi. Esistono molte formule differenti: le più semplici ed utilizzate sono PDA (Potato-Dextrose-Agar), che prevede l'utilizzo di brodo di patate bollite e destrosio (potete usare del normale zucchero), e MEA (Malt Extract-Agar), che invece prevede l'aggiunta di estratto di malto. La prima è un po' più laboriosa, perché richiede una fase di prebollitura delle patate per circa 30 minuti, mentre la seconda è più semplice, perché richiede semplicemente di mescolare l'estratto di malto (che si trova sia in polvere che in sciroppo) all'agar. Ci sono decine e decine di altre formule: ad esempio c'è chi usa l'acqua di cottura degli spinaci, chi usa la farina d'avena, e chi addirittura il cibo per cani (non ci ho provato, e sinceramente non ci tengo!). Io preferisco mantenermi sul semplice, ed utilizzo una leggera variante delle ricette PDA e MEA, che prevede l'aggiunta di 1 grammo di lievito di birra al composto. In questo caso la ricetta si chiamerà PDYA (Potato-Dextrose-Yeast-Agar) o MEYA (Malt Extract- Yeast-Agar). L'aggiunta del lievito, che viene comunque inattivato con la sterilizzazione, permette una crescita migliore e più rapida con la maggior parte delle specie. La regola generale, in ogni caso, è sempre quella della coltura liquida: non devono essere aggiunti troppi nutrienti, poiché altrimenti il micelio diventa "pigro" e cresce lentamente. Noi invece lo vogliamo affamato, che cresca veloce in cerca di nuovo nutrimento.
Bene, direi di iniziare: la ricette che vedremo oggi è la PDYA. Potete comunque trasformarla in PDA semplicemente omettendo di aggiungere il lievito, la differenza non è molta. Riguardo alla quantità, le dosi sono quelle per 20 petri, che generalmente sono quelli che troviamo in una busta.
Sbucciate 150 grammi di patate e tagliatele a cubetti, mettetele in una pentola con 600 ml d'acqua (la dose per 20 petri in realtà è di 500 ml, ma un po' d'acqua evapora sempre durante la cottura)...
...e sobbollite per 30 minuti.
Poi, filtrate il liquido ed assicuratevi che la quantità sia giusta. È sempre meglio aggiungere 50 ml ai 500 richiesti, perché può capitare, soprattutto le prime volte, di versare troppo liquido in qualche petri, e si rischia di rimanere senza prima di averli riempiti tutti e 20 (ogni petri richiede circa 20-25 ml).
Versate il tutto in un barattolo di vetro, ed aggiungete 5 grammi di zucchero. Se il liquido si è raffreddato scaldiamolo per un po' in forno a microonde (altrimenti l'agar non si scioglierà bene).
Dopo di che pesiamo 8 grammi di agar (potete arrivare fino a 10 grammi, e scendere fino a 7,5, ottenendo una densità differente. 8 grammi è un buon compromesso, con quel che costa!)
Ed un grammo di lievito di birra
Fate attenzione che sia vero lievito, e non lievito istantaneo, che è un composto chimico e pertanto non va bene.
Aggiungiamo lievito ed agar al liquido, mescolando rapidamente. Vi ricordo che dev'essere caldo (non bollente) perché il tutto sciolga bene.
Versiamo il tutto in una bottiglia di vetro spesso.
Ovviamente dovete assicurarvi che entri nella vostra pentola a pressione.Nel caso in cui non ne trovaste una, potete utilizzare anche un barattolo abbastanza alto, modificando così il tappo. Ho detto sufficientemente alto perché l'agar bolle in modo molto violento, e se riempito troppo potrebbe traboccare.
Mettiamo una pallina di polyfill in cima alla bottiglia (o al barattolo)...
...e copriamo con un po' di carta stagnola.
A questo punto è tutto pronto per la sterilizzazione. Mettiamo la bottiglia nella pentola e sterilizziamo per 30-45 minuti.
Anche 10 psi vanno bene, trattandosi di un liquido. A tale pressione la pentola (almeno nel mio caso) sfiata meno, e si riducono i rischi che l'agar trabocchi dal recipiente.
Una volta trascorso il tempo necessario,spegnete il gas, e lasciate che la pressione scenda lentamente, senza assolutamente toccare la valvola. In caso contrario, il bilanciamento troppo rapido di pressione provocherà la fuoriuscita dell'agar dalla bottiglia. Una volta che la pressione sarà a zero, aprite la pentola e prelevate la bottiglia, ovviamente con una presina per non bruciarvi.
A questo punto, per poterla usare dovrete aspettare che si raffreddi fino a poter essere toccata a mani nude. Se avete una cappa a flusso laminare potete accenderla e lasciarvi davanti la bottiglia, che diventerà maneggiabile nel giro di 25-30 minuti. Se invece avete una glove-box vi consiglio di lasciare la bottiglia a raffreddarsi a temperatura ambiente, mettendola dentro alla glove-box solo quando è quasi pronta. Mettendola dentro ancora bollente, la condensa vi renderebbe la vita molto difficile. Nel caso in cui pensaste di usare la bottiglia ancora bollente, tenendola in mano con un panno, scordatevelo, perché altrimenti si formerebbe moltissima condensa nelle piastre, che diventerebbero inutilizzabili.
Le piastre petri le potete trovare da molti rivenditori online, o anche in alcune farmacie. Ce ne sono di diversi tipi e dimensioni, io uso quelle da 90 mm ventilate. Non sono riutilizzabili (in pentola a pressione si sciolgono) e dovete maneggiarle con molta cautela, evitando accuratamente di toccarne la parte interna.
Mi raccomando, non prendete esmpio da me, e fate in modo che la vostra area di lavoro sia un po' più ordinata della mia!
Prima di accendere la cappa, è bene spruzzarci un po' di oust da una distanza di 30-40 cm, e pulire bene il piano di lavoro con alcool. Stessa cosa per la glove-box, che è buona cosa pulire accuratamente prima di ogni utilizzo.
A questo punto, dovrete riempire le piastre. Per farvi vedere come, ho preparato un video, peraltro piuttosto brutto, ma spero che renda l'idea. Se cercate su youtube comunque si trova anche di meglio.
Sarebbe buona cosa indossare i guanti anche quando si lavora davanti alla cappa a flusso laminare, però se si ha cura di lavarsi accuratamente le mani non si incontrano problemi.
Una volta che la gelatina nelle piastre si sarà solidificata dovrete sigillarle una per una, sia per mantenerle unite insieme, sia per evitare contaminazioni. Un metodo molto funzionale è quello di tagliare a pezzetti un normale rotolo di pellicola da cucina, sigillando le piastre in questo modo:
Una volta pronte, le piastre possono essere conservate a temperatura ambiente per 1-2 mesi. Per periodi più lunghi è invece buona cosa conservarle in frigo. Generalmente comunque è sempre bene usarle il prima possibile, per evitare le (solite) contaminazioni.
Nel prossimo post vedremo come usare il frutto di questa nostra (ulteriore) fatica!
Alla prossima ;)
In questo post vedremo come preparare la gelatina con cui riempire le piastre petri. Oltre all'agar, dovremo aggiungere al nostro "brodo" anche sostanze nutritive che possano essere metabolizzate dal micelio. In caso contrario la gelatina sarebbe troppo "povera", e non otterremmo alcuna crescita, o quasi. Esistono molte formule differenti: le più semplici ed utilizzate sono PDA (Potato-Dextrose-Agar), che prevede l'utilizzo di brodo di patate bollite e destrosio (potete usare del normale zucchero), e MEA (Malt Extract-Agar), che invece prevede l'aggiunta di estratto di malto. La prima è un po' più laboriosa, perché richiede una fase di prebollitura delle patate per circa 30 minuti, mentre la seconda è più semplice, perché richiede semplicemente di mescolare l'estratto di malto (che si trova sia in polvere che in sciroppo) all'agar. Ci sono decine e decine di altre formule: ad esempio c'è chi usa l'acqua di cottura degli spinaci, chi usa la farina d'avena, e chi addirittura il cibo per cani (non ci ho provato, e sinceramente non ci tengo!). Io preferisco mantenermi sul semplice, ed utilizzo una leggera variante delle ricette PDA e MEA, che prevede l'aggiunta di 1 grammo di lievito di birra al composto. In questo caso la ricetta si chiamerà PDYA (Potato-Dextrose-Yeast-Agar) o MEYA (Malt Extract- Yeast-Agar). L'aggiunta del lievito, che viene comunque inattivato con la sterilizzazione, permette una crescita migliore e più rapida con la maggior parte delle specie. La regola generale, in ogni caso, è sempre quella della coltura liquida: non devono essere aggiunti troppi nutrienti, poiché altrimenti il micelio diventa "pigro" e cresce lentamente. Noi invece lo vogliamo affamato, che cresca veloce in cerca di nuovo nutrimento.
Bene, direi di iniziare: la ricette che vedremo oggi è la PDYA. Potete comunque trasformarla in PDA semplicemente omettendo di aggiungere il lievito, la differenza non è molta. Riguardo alla quantità, le dosi sono quelle per 20 petri, che generalmente sono quelli che troviamo in una busta.
Sbucciate 150 grammi di patate e tagliatele a cubetti, mettetele in una pentola con 600 ml d'acqua (la dose per 20 petri in realtà è di 500 ml, ma un po' d'acqua evapora sempre durante la cottura)...
...e sobbollite per 30 minuti.
Poi, filtrate il liquido ed assicuratevi che la quantità sia giusta. È sempre meglio aggiungere 50 ml ai 500 richiesti, perché può capitare, soprattutto le prime volte, di versare troppo liquido in qualche petri, e si rischia di rimanere senza prima di averli riempiti tutti e 20 (ogni petri richiede circa 20-25 ml).
Versate il tutto in un barattolo di vetro, ed aggiungete 5 grammi di zucchero. Se il liquido si è raffreddato scaldiamolo per un po' in forno a microonde (altrimenti l'agar non si scioglierà bene).
Dopo di che pesiamo 8 grammi di agar (potete arrivare fino a 10 grammi, e scendere fino a 7,5, ottenendo una densità differente. 8 grammi è un buon compromesso, con quel che costa!)
Ed un grammo di lievito di birra
Fate attenzione che sia vero lievito, e non lievito istantaneo, che è un composto chimico e pertanto non va bene.
Aggiungiamo lievito ed agar al liquido, mescolando rapidamente. Vi ricordo che dev'essere caldo (non bollente) perché il tutto sciolga bene.
Versiamo il tutto in una bottiglia di vetro spesso.
Ovviamente dovete assicurarvi che entri nella vostra pentola a pressione.Nel caso in cui non ne trovaste una, potete utilizzare anche un barattolo abbastanza alto, modificando così il tappo. Ho detto sufficientemente alto perché l'agar bolle in modo molto violento, e se riempito troppo potrebbe traboccare.
Mettiamo una pallina di polyfill in cima alla bottiglia (o al barattolo)...
...e copriamo con un po' di carta stagnola.
A questo punto è tutto pronto per la sterilizzazione. Mettiamo la bottiglia nella pentola e sterilizziamo per 30-45 minuti.
Anche 10 psi vanno bene, trattandosi di un liquido. A tale pressione la pentola (almeno nel mio caso) sfiata meno, e si riducono i rischi che l'agar trabocchi dal recipiente.
Una volta trascorso il tempo necessario,spegnete il gas, e lasciate che la pressione scenda lentamente, senza assolutamente toccare la valvola. In caso contrario, il bilanciamento troppo rapido di pressione provocherà la fuoriuscita dell'agar dalla bottiglia. Una volta che la pressione sarà a zero, aprite la pentola e prelevate la bottiglia, ovviamente con una presina per non bruciarvi.
A questo punto, per poterla usare dovrete aspettare che si raffreddi fino a poter essere toccata a mani nude. Se avete una cappa a flusso laminare potete accenderla e lasciarvi davanti la bottiglia, che diventerà maneggiabile nel giro di 25-30 minuti. Se invece avete una glove-box vi consiglio di lasciare la bottiglia a raffreddarsi a temperatura ambiente, mettendola dentro alla glove-box solo quando è quasi pronta. Mettendola dentro ancora bollente, la condensa vi renderebbe la vita molto difficile. Nel caso in cui pensaste di usare la bottiglia ancora bollente, tenendola in mano con un panno, scordatevelo, perché altrimenti si formerebbe moltissima condensa nelle piastre, che diventerebbero inutilizzabili.
Le piastre petri le potete trovare da molti rivenditori online, o anche in alcune farmacie. Ce ne sono di diversi tipi e dimensioni, io uso quelle da 90 mm ventilate. Non sono riutilizzabili (in pentola a pressione si sciolgono) e dovete maneggiarle con molta cautela, evitando accuratamente di toccarne la parte interna.
Mi raccomando, non prendete esmpio da me, e fate in modo che la vostra area di lavoro sia un po' più ordinata della mia!
Prima di accendere la cappa, è bene spruzzarci un po' di oust da una distanza di 30-40 cm, e pulire bene il piano di lavoro con alcool. Stessa cosa per la glove-box, che è buona cosa pulire accuratamente prima di ogni utilizzo.
A questo punto, dovrete riempire le piastre. Per farvi vedere come, ho preparato un video, peraltro piuttosto brutto, ma spero che renda l'idea. Se cercate su youtube comunque si trova anche di meglio.
Sarebbe buona cosa indossare i guanti anche quando si lavora davanti alla cappa a flusso laminare, però se si ha cura di lavarsi accuratamente le mani non si incontrano problemi.
Una volta che la gelatina nelle piastre si sarà solidificata dovrete sigillarle una per una, sia per mantenerle unite insieme, sia per evitare contaminazioni. Un metodo molto funzionale è quello di tagliare a pezzetti un normale rotolo di pellicola da cucina, sigillando le piastre in questo modo:
Una volta pronte, le piastre possono essere conservate a temperatura ambiente per 1-2 mesi. Per periodi più lunghi è invece buona cosa conservarle in frigo. Generalmente comunque è sempre bene usarle il prima possibile, per evitare le (solite) contaminazioni.
Nel prossimo post vedremo come usare il frutto di questa nostra (ulteriore) fatica!
Alla prossima ;)
sabato 29 dicembre 2012
Costruire una cappa a flusso laminare (flowhood)
Abbiamo già visto come costruire la nostra glove-box, che ci permette di lavorare con un elevato grado di sicurezza. Nel medesimo post ho anche accennato alla cappa a flusso laminare (o flowhood): uno strumento molto più evoluto, che ci consentirà di lavorare davvero in sterilità.
Il funzionamento di un flowhood è semplice: un flusso d'aria, creato da una ventola posta sopra o sul retro del'apparecchio, scorre attraverso un filtro in microfibra con una trama molto fitta. L'aria che fuoriesce dal filtro è completamente sterile, poiché ogni possibile contaminante viene trattenuto dal filtro. Solo pochissimi tipi di virus e batteri sono in grado di passare attraverso la trama del filtro, fatto che rende il flowhood uno strumento davvero molto efficiente. Soprattutto, è davvero comodo, perché permette di lavorare in totale libertà, a patto che non si esca dall'area del filtro. Esistono diversi tipi di filtro, il più usato è il tipo HEPA (in inglese High Efficiency Particulate Air filter), che generalmente ha una capacità di filtraggio del 99,995%. Più evoluto è il tipo ULPA (Ultra Low Penetration Air), che invece arriva ad un'efficienza del 99.999995% (tuttavia, pare che i filtri ULPA tendano ad ostruirsi più facilmente degli HEPA).
Come già accennato, il costo di un flowhood non è indifferente, si spendono tranquillamente 300 €, se non più.
In questo post vedremo come costruirne uno, poiché reperirne uno già assemblato non è proprio semplice. Poiché non ho la possibilità di costruirne uno ex-novo per scrivere la guida, mi limiterò a tradurne una dall'inglese, a mio parere fatta molto bene. Potete reperire il testo dell'originale a questo indirizzo. Anno, il proprietario del sito, molto gentilmente mi ha dato il permesso i utilizzare anche le immagini, e lo ringrazio :)
Oltre a tradurre e adattare il testo, ho convertito anche le unità di misura americane nel nostro più comprensibile sistema metrico decimale. La conversione non è stata semplicissima per me che di fisica e matematica capisco ben poco, per cui nel caso in cui individuaste qualche errore, vi prego di segnalarmelo.
Bene, iniziamo pure:
La dimensione del filtro HEPA dipende da quanto grande volete che sia la vostra area di lavoro. Il filtro più piccolo che potrete ragionevolmente utilizzare (per una coltivazione su piccola scala) è di 30x30 cm. In ogni caso, un filtro di 60x60 è molto più comodo, ed è praticamente indispensabile se vorrete utilizzare il vostro filtro per inoculare buste di substrato sterilizzato.
Trovare un filtro HEPA adatto non è semplicissimo, vi consiglio di fare qualche ricerca su google, esistono diversi rivenditori online.
Ogni filtro ha una certa "resistenza" nel momento in cui l'aria vi scorre attraverso ad una certa velocità; questa resistenza è chiamata "pressione statica".
Prrova a premerti una mano sulla bocca. Adesso prova a soffiare: a seconda di quanto forte premete, avrete qualche difficoltà nel soffiare, e percepirete una certa resistenza; questa è la pressione statica.
Ogni filtro ha una differente pressione statica al raggiungimento del "punto di funzionamento". Il punto di funzionamento viene raggiunto nel momento in cui la portata del flusso d'aria diviene costante, e soddisfa i requisiti del flusso laminare ottimale.
La pressione statica si misura in Pascal (Pa). Ogni filtro ha una scheda tecnica (chiedete al costruttore se nel vostro non c'è), in cui è indicata la pressione statica al punto di funzionamento. Prima che l'aria entri nella ventola, passa da un altro filtro (un normale filtro per cappa va bene), spesso più o meno 2,5 cm, posizionato davanti alla ventola. Questo prende il nome di pre-filtro, e la sua funzione è quella di proteggere la ventola ed il filtro HEPA dalle particelle più grandi, come polvere e capelli. La pressione statica di un pre-filtro di 2,5 cm al punto di funzionamento sarà più o meno intorno ai 50 Pa.
Nel libro di Paul Stamets e J. S. Chilton "The Mushroom Cultivator" è indicato che la velocità dell'aria che fuoriesce dal filtro dovrebbe essere di almeno 30 metri al minuto (0,5 metri al secondo). Per calcolare quanto dovrà essere potente il motore del flowhood dovrete fare alcuni calcoli:
1) Calcolate l'area del vostro filtro, moltiplicando base per altezza:
es. 60x60= 3600 cm², che equivalgono a 0.36 metri quadrati
2) Moltiplicate la velocità ideale dell'aria (30 metri al minuto) per l'area del filtro:
30 m/min x 0.36 m² = 10,8 m³/min (cioè metri cubi al minuto). Tale valore, convertito in m³/h (metri cubi orari), equivale a 648.
Quindi, 648 m³/h è l'efficienza che la nostra ventola dovrà avere per poter produrre un flusso d'aria di 30 metri al minuto, con un filtro dall'area di 0,36 m². Tale flusso dovrà essere prodotto in corrispondenza della resistenza statica opposta dal filtro HEPA e dal prefiltro (nel nostro esempio 550 Pa totali).
Nell'immagine seguente è rappresentato un grafico per 4 diversi modelli di ventola (numerati 1, 2, 3 e 4).
NOTA: Ogni modello di ventola ha la sua particolare curva.
Come potete chiaramente vedere, ad una maggiore pressione statica corrisponde una minore quantità d'aria, fino al valore massimo di pressione, ove la quantità d'aria fuoriuscita è pari a zero.
Nel grafico e nella tabella qui sopra il valore di 550 Pa non è contemplato, credo comunque che siano risultati utili per capirci meglio :)
Tornando a noi, adesso siappiamo quanta aria dovrà essere in grado di muovere la nostra ventola, ed a quale pressione statica. Poiché difficilmente potremo trovare una ventola che rilasci esattamente 648 m³/h in corrispondenza di una pressione statica di 550 Pa, dovremo scegliere quella che si avvicini di più a tale rapporto. Per sicurezza, è meglio scegliere una ventola leggermente più potente del dovuto, rispetto ad una che invece non arriva a fornire la quantità ideale di aria. In ogni caso però, la ventola non dovrà fornire più del 20% dell'aria che abbiamo calcolato. Per cui, nel nostro caso, il valore accettabile più alto è di circa 780 m³/h.
Una volta reperiti filtro HEPA e relativa ventola (operazione non semplice), il 50% del lavoro sarà da considerarsi già svolto.
Nelle foto che seguono, potete vedere come assemblare un flowhood completo. Il "motore" utilizzato dal costruttore è un aspiratore assiale centrifugo, di quelli normalmente usati nelle cappe. Il mio monta invece un ventilatore assiale, che è meno ingombrante ma fa esattamente la stessa cosa. Un'altra opzione valida è quella di ricorrere ad un ventilatore a gabbia di scoiattolo (che ho utilizzato con successo per costruire il mio secondo flowhood "portatile").
Potete benissimo usare delle tavole di legno, anche il compensato va bene, purché sufficientemente resistente.
Nella tavola di legno viene praticato un foro per permettere al motore di aspirare l'aria dall'esterno
Ed ecco qua il flowhood completo: adesso c'è solo da mettere il prefiltro...
In questo caso è stato usato un filtro da forno. Si possono usare anche altri tipi di filtro, come quelli per acquari, impianti aria delle auto, e cappe da cucina. Assicuratevi comunque che la pressione statica non sia eccessiva, altrimenti vi servirà una ventola più potente.
Viene applicata una protezione davanti al filtro (pare una zanzariera) per evitare di danneggiarlo toccandolo accidentalmente (potete usare altri tipi di protezione, ad esempio una fitta rete metallica):
Ed ecco qui il lavoro ultimato.
Non si può dire che sia bello, ma di sicuro è funzionale, ed anni luce avanti rispetto ad una glove-box. Poi, come sempre, sta a voi migliorare se possibile le vostre tecniche, se ve la cavate un po' con il fai-da-te potrete raggiungere risultati migliori di questo. Ad esempio, in questo secondo esempio il pre-filtro è stato "incassato" all'interno della struttura in legno, così da evitare che sporga.
Bene, spero che questo post vi sia servito per capire cosa è un flowhood, come funziona e come costruirlo. Probabilmente è ancora un po' presto per cimentarvi nella sua costruzione, ma spero che questa guida possa tornarvi utile in futuro. Vi ricordo che l'originale è reperibile qui.
Alla prossima ;)
Il funzionamento di un flowhood è semplice: un flusso d'aria, creato da una ventola posta sopra o sul retro del'apparecchio, scorre attraverso un filtro in microfibra con una trama molto fitta. L'aria che fuoriesce dal filtro è completamente sterile, poiché ogni possibile contaminante viene trattenuto dal filtro. Solo pochissimi tipi di virus e batteri sono in grado di passare attraverso la trama del filtro, fatto che rende il flowhood uno strumento davvero molto efficiente. Soprattutto, è davvero comodo, perché permette di lavorare in totale libertà, a patto che non si esca dall'area del filtro. Esistono diversi tipi di filtro, il più usato è il tipo HEPA (in inglese High Efficiency Particulate Air filter), che generalmente ha una capacità di filtraggio del 99,995%. Più evoluto è il tipo ULPA (Ultra Low Penetration Air), che invece arriva ad un'efficienza del 99.999995% (tuttavia, pare che i filtri ULPA tendano ad ostruirsi più facilmente degli HEPA).
Come già accennato, il costo di un flowhood non è indifferente, si spendono tranquillamente 300 €, se non più.
In questo post vedremo come costruirne uno, poiché reperirne uno già assemblato non è proprio semplice. Poiché non ho la possibilità di costruirne uno ex-novo per scrivere la guida, mi limiterò a tradurne una dall'inglese, a mio parere fatta molto bene. Potete reperire il testo dell'originale a questo indirizzo. Anno, il proprietario del sito, molto gentilmente mi ha dato il permesso i utilizzare anche le immagini, e lo ringrazio :)
Oltre a tradurre e adattare il testo, ho convertito anche le unità di misura americane nel nostro più comprensibile sistema metrico decimale. La conversione non è stata semplicissima per me che di fisica e matematica capisco ben poco, per cui nel caso in cui individuaste qualche errore, vi prego di segnalarmelo.
Bene, iniziamo pure:
Iniziamo:
La prima cosa da fare è capire come scegliere il filtro HEPA e la ventola (ne esistono di diversi tipi).La dimensione del filtro HEPA dipende da quanto grande volete che sia la vostra area di lavoro. Il filtro più piccolo che potrete ragionevolmente utilizzare (per una coltivazione su piccola scala) è di 30x30 cm. In ogni caso, un filtro di 60x60 è molto più comodo, ed è praticamente indispensabile se vorrete utilizzare il vostro filtro per inoculare buste di substrato sterilizzato.
Trovare un filtro HEPA adatto non è semplicissimo, vi consiglio di fare qualche ricerca su google, esistono diversi rivenditori online.
Abbinare una ventola adatta al filtro:
Una volta che avrete deciso la dimensione del filtro HEPA, dovrete procurarvi una ventola adatta, abbastanza potente da permettere all'aria di fuoriuscire dal filtro con una potenza sufficiente. Si tratta di un passaggio molto importante, perciò fate molta attenzione.Ogni filtro ha una certa "resistenza" nel momento in cui l'aria vi scorre attraverso ad una certa velocità; questa resistenza è chiamata "pressione statica".
Prrova a premerti una mano sulla bocca. Adesso prova a soffiare: a seconda di quanto forte premete, avrete qualche difficoltà nel soffiare, e percepirete una certa resistenza; questa è la pressione statica.
Ogni filtro ha una differente pressione statica al raggiungimento del "punto di funzionamento". Il punto di funzionamento viene raggiunto nel momento in cui la portata del flusso d'aria diviene costante, e soddisfa i requisiti del flusso laminare ottimale.
La pressione statica si misura in Pascal (Pa). Ogni filtro ha una scheda tecnica (chiedete al costruttore se nel vostro non c'è), in cui è indicata la pressione statica al punto di funzionamento. Prima che l'aria entri nella ventola, passa da un altro filtro (un normale filtro per cappa va bene), spesso più o meno 2,5 cm, posizionato davanti alla ventola. Questo prende il nome di pre-filtro, e la sua funzione è quella di proteggere la ventola ed il filtro HEPA dalle particelle più grandi, come polvere e capelli. La pressione statica di un pre-filtro di 2,5 cm al punto di funzionamento sarà più o meno intorno ai 50 Pa.
Nel libro di Paul Stamets e J. S. Chilton "The Mushroom Cultivator" è indicato che la velocità dell'aria che fuoriesce dal filtro dovrebbe essere di almeno 30 metri al minuto (0,5 metri al secondo). Per calcolare quanto dovrà essere potente il motore del flowhood dovrete fare alcuni calcoli:
1) Calcolate l'area del vostro filtro, moltiplicando base per altezza:
es. 60x60= 3600 cm², che equivalgono a 0.36 metri quadrati
2) Moltiplicate la velocità ideale dell'aria (30 metri al minuto) per l'area del filtro:
30 m/min x 0.36 m² = 10,8 m³/min (cioè metri cubi al minuto). Tale valore, convertito in m³/h (metri cubi orari), equivale a 648.
Quindi, 648 m³/h è l'efficienza che la nostra ventola dovrà avere per poter produrre un flusso d'aria di 30 metri al minuto, con un filtro dall'area di 0,36 m². Tale flusso dovrà essere prodotto in corrispondenza della resistenza statica opposta dal filtro HEPA e dal prefiltro (nel nostro esempio 550 Pa totali).
Trovare la ventola adatta:
Ogni ventola ha abbinata una scheda in cui è indicata la correlazione tra la portata volumetrica e la pressione statica, rappresentata con un grafico od una tabella.Nell'immagine seguente è rappresentato un grafico per 4 diversi modelli di ventola (numerati 1, 2, 3 e 4).
NOTA: Ogni modello di ventola ha la sua particolare curva.
Come potete chiaramente vedere, ad una maggiore pressione statica corrisponde una minore quantità d'aria, fino al valore massimo di pressione, ove la quantità d'aria fuoriuscita è pari a zero.
A volte invece, i medesimi dati sono presentati con una tabella:
Tornando a noi, adesso siappiamo quanta aria dovrà essere in grado di muovere la nostra ventola, ed a quale pressione statica. Poiché difficilmente potremo trovare una ventola che rilasci esattamente 648 m³/h in corrispondenza di una pressione statica di 550 Pa, dovremo scegliere quella che si avvicini di più a tale rapporto. Per sicurezza, è meglio scegliere una ventola leggermente più potente del dovuto, rispetto ad una che invece non arriva a fornire la quantità ideale di aria. In ogni caso però, la ventola non dovrà fornire più del 20% dell'aria che abbiamo calcolato. Per cui, nel nostro caso, il valore accettabile più alto è di circa 780 m³/h.
Una volta reperiti filtro HEPA e relativa ventola (operazione non semplice), il 50% del lavoro sarà da considerarsi già svolto.
Nelle foto che seguono, potete vedere come assemblare un flowhood completo. Il "motore" utilizzato dal costruttore è un aspiratore assiale centrifugo, di quelli normalmente usati nelle cappe. Il mio monta invece un ventilatore assiale, che è meno ingombrante ma fa esattamente la stessa cosa. Un'altra opzione valida è quella di ricorrere ad un ventilatore a gabbia di scoiattolo (che ho utilizzato con successo per costruire il mio secondo flowhood "portatile").
Assemblaggio:
Dopo esservi procurati il filtro HEPA ed una ventola adatta, dovrete procurarvi alcuni materiali per la costruzione dell'apparecchio. Sostanzialmente si stratta di costruire una scatola: il lato frontale consisterà nel filtro HEPA, ed un altro lato avrà l'apertura per la ventola, con il pre-filtro montato.Potete benissimo usare delle tavole di legno, anche il compensato va bene, purché sufficientemente resistente.
In questo caso la ventola è stata montata nella parte superiore. Potete comunque montarla anche sul retro.
Nella tavola di legno viene praticato un foro per permettere al motore di aspirare l'aria dall'esterno
Ed ecco qua il flowhood completo: adesso c'è solo da mettere il prefiltro...
In questo caso è stato usato un filtro da forno. Si possono usare anche altri tipi di filtro, come quelli per acquari, impianti aria delle auto, e cappe da cucina. Assicuratevi comunque che la pressione statica non sia eccessiva, altrimenti vi servirà una ventola più potente.
Viene applicata una protezione davanti al filtro (pare una zanzariera) per evitare di danneggiarlo toccandolo accidentalmente (potete usare altri tipi di protezione, ad esempio una fitta rete metallica):
Ed ecco qui il lavoro ultimato.
Non si può dire che sia bello, ma di sicuro è funzionale, ed anni luce avanti rispetto ad una glove-box. Poi, come sempre, sta a voi migliorare se possibile le vostre tecniche, se ve la cavate un po' con il fai-da-te potrete raggiungere risultati migliori di questo. Ad esempio, in questo secondo esempio il pre-filtro è stato "incassato" all'interno della struttura in legno, così da evitare che sporga.
Bene, spero che questo post vi sia servito per capire cosa è un flowhood, come funziona e come costruirlo. Probabilmente è ancora un po' presto per cimentarvi nella sua costruzione, ma spero che questa guida possa tornarvi utile in futuro. Vi ricordo che l'originale è reperibile qui.
Alla prossima ;)
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